Главная > Химия > Биохимия, Т.1
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

7.3. Поиски активного центра лизоцима

Детальное воспроизведение трехмерной структуры лизоцима еще не раскрывало механизма его каталитического действия. Более того, рассматривая карту электронной плотности, трудно было определить хотя бы локализацию активного центра. В отличие от миоглобина и гемоглобина в лизоциме нет простетической группы, т. е. нет встроенного маркера активного центра. В итоге основную информацию, необходимую для идентификации активного центра, определения способа связывания субстрата и выяснения механизма ферментативного действия, удалось получить только при использовании ингибиторов, а именно при рентгеноструктурном анализе комплексов лизоцима с ингибиторами. Если трехмерная структура белка известна, то определить методом рентген оструктурн ого анализа способ связывания с ним небольших молекул обычно уже нетрудно. Эти опыты легко выполнимы, потому что кристаллы белка очень пористы. Даже относительно большие молекулы ингибитора способны диффундировать по каналам между молекулами белка, попадая в участки специфического связывания. Изменение электронной плотности, обусловленное встраиванием дополнительной молекулы, можно рассчитать непосредственно по интенсивности рефлексов

Рис. 7.5. Последовательность аминокислот в лизоциме из белка куриных яиц. Красным показаны остатки, входящие в состав активного центра. [Canfield R. Е., Liu А. К., J.Biol. Chem., 240, 2000 (1965); Phillips D.C, Sci. Amer., (5) 215, 79 (1966).]

(используя данные, полученные предварительно на нативном белке) при условии, что структура кристалла не претерпела существенных изменений. Такой подход получил название разностного метода Фурье.

Рис. 7.6. Рентгенограмма кристалла лизоцима. (Печатается с любезного разрешения д-ра D. Phillips.)

В идеале следовало бы использовать разностный метод Фурье для определения структуры фермент-субстратного (ES) комплекса в процессе катализа. Однако в обычных условиях превращение связанного субстрата в продукт реакции происходит значительно быстрее, чем диффузия новых молекул субстрата в кристалл. В некоторых случаях это осложнение удается устранить

Рис. 7.7. Трехмерная структура лизоцима. Показаны только -угле-родные атомы. (Печатается с любезного разрешения д-ра D. Phillips.)

Рис. 7.8. Формула три--ацетилглюко-замина (три-NAG, или конкурентного ингибитора лизоцима.

замедлением каталитического процесса, что достигается путем сильного охлаждения кристалла (например, до — Этот экспериментальный подход получил название криоэнзимологии. Существует и другой подход: исследуют комплекс фермента с таким аналогом субстрата, который либо совсем не подвергается никаким превращениям, либо эти превращения происходят очень медленно. Для лизоцима таким аналогом субстрата оказался тример N-ацетилглюкоза-мина (три - или структура которого показана на рис. 7.8. Олигомеры N-ацетилглюкозамина, содержащие менее 5 остатков, гидролизуются крайне медленно или не гидролизуются совсем. Тем не менее они связываются с активным центром фермента. Именно поэтому три-NAG является мощным конкурентным ингибитором лизоцима.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление