Главная > Химия > Биохимия, Т.3
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

31.9. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза - необходимые инструменты для получения рекомбинантных молекул ДНК

Молекулы ДНК можно легко соединять in vitro с помощью рестриктирующих эндонуклеаз (разд. 24.27), ДНК-лигаз (разд. 24.15) и других высокоспецифических ферментов, действующих на ДНК. В эксперименте по получению рекомбинантной ДНК вектор подготавливают к соединению с клонируемым фрагментом путем расщепления в одном определенном месте с помощью рестрикционной эндонуклеазы. Например, небольшую плазмиду можно расщепить в одном месте ферментом рестрикции Если с помощью этого фермента две

Рис. 31.19. Соединение молекул ДНК с помощью метода липких концов. Одна из родительских молекул ДНК (показано зеленым цветом) несет гены разделенные участком рестрикции, а другая (красный цвет) несет гены Одна из рекомбинантных молекул несет гены а другая -

Рис. 31.20. Соединение молекул ДНК с помощью наращивания -концов (коннек-торным методом).

цепи ДНК расщепить наискосок, то образуются комплементарные одноцепочечные концы (липкие концы). Предположим теперь, что фрагмент ДНК, который необходимо ввести в эту плазмиду, образован путем расщепления большой молекулы ДНК эндонуклеазой Тогда одноцепочечные концы этого фрагмента будут комплементарны концам расщепленной плазмиды. Теперь фрагмент ДНК и плазмиду можно подвергнуть отжигу и соединить ДНК-лигазой (рис. 31.19). Затем бактерии инкубируют в присутствии этой смеси молекул ДНК. Небольшую часть бактерий, несущих плазмиду, отбирают, исходя из того что сообщает клеткам устойчивость к тетрациклину. Затем используют другой метод отбора для выявления клонов, содержащих плазмиду со встроенной ДНК.

Второй метод соединения двух неродственных молекул ДНК основан на присоединении ро1уА)-фрагментов к обоим 3-концам одной молекулы и ро1уТ)-фраг-ментов к обоим 3-концам другой молекулы (рис. 31.20). Эти гомополимерные последовательности синтезируются терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазой (терминальной трансферазой) - ферментом, присоединяющим нуклеотиды к 3-гидроксиль-ной группе цепи ДНК. Эта трансфераза в отличие от ДНК-полимеразы не зависит от матрицы, поэтому с ее помощью можно присоединить последовательности из ну-клеотидов только одного тина (обычно длиной 100 остатков). -концы одной молекулы ДНК отжигают с poly(dT)-концами другой. Длины этих концевых последовательностей могут несколько колебаться, поэтому, прежде чем соединить цепи ДНК-лигазой, бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы Точно так же можно использовать для соединения различных молекул ДНК и концевые poly(dG)- и poly(dC)-последовательности.

Третий подход к соединению молекул

Рис. 31.21. Образование липких концов путем присоединения и расщепления химически синтезированного линкера.

ДНК сочетает преимущества метода липких концов с универсальным характером -метода (коннекторного). К концам фрагмента ДНК или вектора ковалентно присоединяют химически синтезированный линкер, т.е. связующую цепь (длиной от шести до десяти пар оснований), чувствительный к расщеплению каким-либо ферментом рестрикции. -концы десятинуклеотидного линкера и молекулы ДНК фосфорилируют полинуклеотидкиназой и соединяют лигазой фага Т4, которая может образовывать ковалентную связь между молекулами ДНК с тупыми концами. Если обработать эти концевые участки соответствующим ферментом рестрикции, образуются липкие концы (рис. 31.21). Таким образом, почти у любой молекулы ДНК можно вызвать образование липких концов, соответствующих специфичности данного фермента рестрикции.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление