Главная > Химия > Биохимия, Т.3
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

31.11. Из суммарной геномной ДНК, расщепленной рестриктирующими эндонуклеазами, можно выделить с помощью клонирования определенные эукариотические гены

Как уже говорилось в предыдущей главе, исследование эукариотических геномов представляет огромные трудности. Ген длиной составляет генома Е. coli и всего лишь генома млекопитающих. Методы рекомбинантных ДНК позволяют в настоящее время вводить эукариотический ген в Е. coli, что сильно упрощает задачу. Эксперимент начинается с частичного расщепления ДНК эукариотического генома, чтобы получить случайные фрагменты со средней длиной примерно (рис. 31.25). К концам этих фрагментов присоединяют синтетические линкеры, образуют липкие концы и затем присоединяют к какому-нибудь вектору, например к ДНК фага При упаковке ДНК в вирионы in vitro происходит отбор рекомбинантных молекул ДНК, содержащих большие вставки. Затем этими рекомбинантными фагами заражают клетки Е. coli. Получается лизат, содержащий фрагменты эукариотической ДНК, заключенной в фаги и размноженной примерно в миллион раз. Этот лизат представляет собой

Рис. 31.24. В качестве вектора для клонирования может быть использован мутант фага X. В ходе реакции упаковки фага происходит отбор молекул ДНК, содержащих вставку.

библиотеку клонированной эукариотической ДНК.

Затем в такой библиотеке можно провести отбор для идентификации фаговых клонов, содержащих нужный эукариотический ген. Вычисление показывает, что лишь один из 180000 клонов будет содержать уникальный эукариотический ген. Поэтому необходима очень быстрая и эффективная процедура отбора. Она основана на гибридизации. Присутствие определенной последовательности ДНК в одной бляшке фага X можно выявить с помощью радиоактивной молекулы комплементарной ДНК или РНК в качестве гибридизационной пробы. Связывание этой пробы можно обнаружить методом радиоавтографии. Таким образом, можно проверить 1 млн. клонов за один день. Итак, клон, соответствующий определенному эукариотическому гену, можно легко идентифицировать и выделить при условии, что имеется транскрибированная с него РНК в более или менее чистом виде.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление