Главная > Химия > Биохимия, Т.3
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

24.27. Рестриктирующие эндонуклеазы совершили переворот в анализе ДНК

Ферменты рестрикции - эндонуклеазы, способные узнавать определенные последовательности оснований в двухспиральной ДНК и расщеплять обе цепи. Эти исключительно тонкие скальпели - великолепный подарок природы биохимикам. Существование ферментов рестрикции позволило проводить эксперименты, о которых нельзя было даже и мечтать всего лишь несколько лет назад. Они представляют собой незаменимые инструменты для исследования

Рис. 24.47. Остатки уранила в ДНК вырезаются и замещаются цитозином - исходным основанием.

Палиндром (перевертыш) - слово, предложение или стих, которые читаются одинаково слева направо и справа налево.


структуры хромосомы, определения последовательности нуклеотидов в очень длинных молекулах ДНК, выделения генов и получения новых молекул ДНК для клонирования. Разработку всех этих методов начали Вернер Арбер, Гамилтон Смит и Дэниел Натанс (Werner Arber, Hamilton Smith, Daniel Nathans).

Рестриктирующие эндонуклеазы обнаруживаются у самых различных прокариот. Биологическая роль этих ферментов состоит в том, чтобы расщеплять чужеродные молекулы ДНК. Собственная клеточная ДНК при этом не расщепляется, так как участки, узнаваемые своими ферментами рестрикции, у нее метилированы. Взаимосвязь между ресткрикцией и модификацией рассматривается в гл. 30 (разд. 30.9). Важное значение имеет тот факт, что многие ферменты рестрикции узнают специфические последовательности ДНК длиной от четырех до шести пар оснований и гидролизуют фосфодиэфирные связи в обеих цепях в этой области. Удивительная особенность таких участков расщепления - их симметрия относительно оси вращения второго порядка. Другими словами, узнаваемая последовательность пар оснований представляет собой палиндром.

Расщепляемые участки расположены симметрично относительно оси второго порядка. Например, фермент рестрикции из Streptomyces achromogenes узнает последовательность

В каждой цепи эта эндонуклеаза рвет фосфодиэфирную связь между дистальную по отношению к оси симметрии. К настоящему времени очищено и охарактеризовано более 80 ферментов рестрикции. Их названия состоят из сокращенного до трех букв названия микроорганизма (например, Есо от E.coli, Hin от Haemophilus influenzae, Нае от Haeguptins), обозначения штамма и римской цифры. Специфичность некоторых ферментов показана на рис. 24.48. Обратите внимание, что производимые в двух цепях разрывы могут быть расположены либо со сдвигом относительно друг друга, либо строго против друг друга.

Ферменты рестрикции используются для расщепления молекул ДНК на определенные фрагменты, которые более удобны для анализа и манипулирования, чем исходная молекула. Например, расщепляет кольцевую двухцепочечную ДНК вируса SV-40 длиной только в одном месте, в четырех местах и в 11 местах. Кусок ДНК, образованный одним ферментом рестрикции, можно специфически расщепить на более мелкие фрагменты с помощью другого фермента. Используя несколько ферментов рестрикции, можно картировать хромосомы (разд. 31.8). Более того, набор фрагментов, полученных с помощью ферментов рестрикции, может служить своего рода «отпечатком пальца» для соответствующей молекулы ДНК. Небольшие различия между сходными молекулами ДНК можно легко выявить с помощью электрофоретического разделения их рестрикционных фрагментов. Для каждого данного геля электрофоретическая подвижность фрагмента ДНК обратно пропорциональна логарифму числа пар оснований определенного предела длины фрагментов). Для разделения фрагментов ДНК длиной до 1000 пар оснований используют полиакриламидный гель, а для

Рис. 24.48. Специфичность некоторых эндонуклеаз рестрикции. Последовательности пар оснований, узнаваемые этими ферментами, имеют ось симметрии второго порядка. Две цепи ДНК в этой области симметричны относительно оси, обозначенной зеленым овалом. (Одна цепь сдвинута относительно другой на 180°.) Места расщепления показаны красными стрелками. Сокращенные названия каждого фермента рестрикции приведены справа от последовательности, которую он узнает.

разделения более длинных молекул более пористый агарозный гель. Если ДНК содержит радиоактивную метку, полосы можно выявить методом радиоавтографии. В другом случае гель можно покрасить бромистым этидием, который при связывании с двухспиральной ДНК флуоресцирует ярким оранжевым светом. При использовании этого способа можно легко увидеть полосу, содержащую (рис. 24.49). Помимо чувствительности, важное достоинство таких гелей - их высокая разрешающая способность.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление