Главная > Химия > Биохимия, Т.3
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

24.28. Последовательность нуклеотидов в ДНК можно быстро определить с помощью специфического химического расщепления

Появление надежных методов определения последовательности нуклеотидов в молекулы ДНК облегчило также изучение структуры ДНК и ее связи с экспрессией гена. Метод химического расщепления, разработанный Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом (Allan Maxam, Walter Gilbert), основан на использовании ДНК, меченной по одному из концов одной из цепей. Для введения в -гидроксильный конец обычно используют полинуклеотидкиназу. Меченую ДНК расщепляют предпочтительно по одному из четырех нуклеотидов. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую цепь приходился в среднем один разрыв.

Рис. 24.49. Электрофоретическое разделение фрагментов, образующихся при расщеплении ДНК SV-40 тремя различными ферментами рестрикции. Эти фрагменты флуоресцируют благодаря тому, что гель окрашен бромистым этидием. (Печатается с любезного разрешения д-ра Jeffrey Sklar.)

Частичное расщепление по каждому основанию дает набор радиоактивных фрагментов, начинающихся -меткой и кончающихся одним из положений этого основания. Например, если исследуемая ДНК имеет последовательность

то в результате специфического расщепления с -стороны каждого из четырех оснований получатся следующие радиоактивные фрагменты:

Затем эти фрагменты разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, который дает возможность разделять молекулы ДНК, различающиеся по длине всего лишь на один нуклеотид. Следующий этап - радиоавтография этого геля. Как показано на рис. 24.50, самая нижняя полоса расположена на дорожке, соответствующей расщеплению по С, следующая - на дорожке затем еще одна - на дорожке А. Следовательно, последовательность первых трех нуклеотидов имеет вид Если прочитать все семь полос снизу вверх, получится последовательность Итак, радиоавтограф геля, полученного после четырех различных реакций химического расщепления, дает набор полос, по которым можно непосредственно прочитать нужную последовательность.

Как достигается специфическое расщепление ДНК? Для этого используют соединения, которые способны модифицировать основание и затем отщеплять его от остатка сахара (рис. 24.51). Пурины модифицируют диметилсульфатом, метилирующим гуанин по и аденин по Расщепление гликозидной связи метилированного пурина легко достигается нагреванием при нейтральном значении рН.

В результате основание отделяется от соответствующего остатка сахара. Затем смесь нагревают в щелочи, что вызывает расщепление сахарофосфатного остова ДНК и удаление остатка сахара. В результате образуются фрагменты, несущие на конце метку. Эти фрагменты разделяют в полиакриламидном геле и на радиоавтографе получают картину полосы различной интенсивности. Темные полосы соответствуют фрагментам, образовавшимся при расщеплении по гуанину, так как гуанин метилируется гораздо быстрее, чем аденин. В то же время гликозидная связь в метилированном аденозине менее стабильна, чем в метилированном гуанозине. Поэтому при обработке разбавленной кислотой после метилирования происходит предпочтительное выщепление аденина (получается дорожка Сравнение дорожки с параллельной дорожкой G на том же геле показывает, происходит ли расщепление по А или по G (рис. 24.52). Расщепление по цитозину и тимину проводят гидразином. Остов затем расщепляют

Рис. 24.50. Схематическое изображение геля, на котором показаны радиоактивные фрагменты, образовавшиеся при специфическом расщеплении последовательности по каждому из четырех оснований (дорожки Слева указано число нуклеотидов в каждом фрагменте. Последовательность оснований читается непосредственно с геля снизу вверх.

Рис. 24.51. Стратегия метода определения последовательности нуклеотидов в ДНК с помощью химического расщепления.

пиперидином, который вытесняет продукты реакции с гидразином и катализирует элиминацию фосфатов. В результате расщепления по цитозинам и тиминам получают серию полос примерно равной интенсивности (дорожка С Эти пиримидины различают, проводя гидразинолиз в присутствии подавляющим реакцию с тимином (дорожка С). Теперь последовательность ДНК можно прочитать по радиоавтографу геля, сопоставляя дорожки (рис. 24.52). Самый короткий фрагмент имеет самую высокую электрофоретическую подвижность, так что -концу соответствует низ геля. Если использовать несколько различных гелей для разделений всех меченых фрагментов, можно легко определить таким образом последовательности длиной более 150 пар оснований.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление