Главная > Химия > Биохимия, Т.3
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

25.19. Разработаны совершенные методы определения последовательности нуклеотидов в РНК

Высокая разрешающая способность метода гель-электрофореза дает возможность быстро определять последовательности нуклеотидов как в молекулах РНК, так и

Рис. 25.22. (см. скан) Структура актиномицина

в молекулах ДНК. Для этого 3- или -ко-нец цепи РНК метят радиоактивной группой. Затем меченую цепь частично расщепляют по одному из четырех оснований, чтобы получить набор фрагментов. Специфическое (или избирательное) расщепление можно провести с помощью ферментов, специфичных к определенному основанию эндонуклеаз (табл. 25.4). Например, рибонуклеаза Т гидролизует -стороны остатков G. Кроме того, РНК можно специфически расщепить с помощью химической модификации одного из четырех оснований. Затем остов расщепляют в месте, где расположено модифицированное основание. После этого четыре набора фрагментов разделяют гель-электрофорезом и последовательность оснований РНК читают непосредственно с радиоавтографа (рис. 25.24), как и в случае ДНК (разд. 24.28). Эти подходы позволяют легко определять в молекулах РНК последовательность 100-200 нуклеотидов.

Другая стратегия сводится к тому, чтобы определять последовательность нуклеотидов не в самой РНК, а в комплементарной ДНК. Но как получить комплементарные фрагменты ДНК? Один из методов состоит в следующем. С помощью рестрикционных эндонуклеаз фрагментируют большие молекулы ДНК. Затем методом гибридизации идентифицируют ре-стрикционные фрагменты, содержащие последовательность, комплементарную исследуемой РНК. В другом случае комплементарную ДНК синтезируют ферментативно по РНК-матрице с помощью обратной транскриптазы из опухолеродных вирусов (разд. 30.19). Именно так была расшифрована полная последовательность 576 нуклеотидов мРНК, колирующей -цепь гемоглобина человека.

Заключение

Поток генетической информации в нормальных клетках происходит в направлении: ДНК - РНК - белок. Синтез РНК по ДНК-матрице называется транскрипцией, а синтез белка по РНК-матрице -трансляцией. Существует три типа

(см. скан)

Рис. 25.24. Радиоавтограф фрагмента дрожжей. 3-конец помечен радиоактивной меткой. Четыре дорожки соответствуют расщеплению по остаткам На геле можно прочитать последовательность , Ргос. Nat. Acad. Sci., 76, 1762 (1979).]

молекул РНК: информационная РНК (мРНК), транспортная РНК (тРНК) и рибосомная РНК (рРНК). Все эти РНК одноцепочечные. Транспортная РНК и рибосомная РНК содержат протяженные двухспиральные участки, которые образуются при складывании цепи в шпильки. Самыми маленькими молекулами РНК являются тРНК; они содержат около 75 нуклеотидов. Самые длинные молекулы РНК встречаются среди мРНК; они могут содержать более 5000 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов в длинных цепях РНК можно определить, расщепляя их и разделяя фрагменты гель-электрофорезом.

Все клеточные РНК синтезирует РНК-полимераза в соответствии с последовательностью ДНК-матрицы. Активированными промежуточными продуктами служат рибонуклеозидтрифосфаты. Синтез РНК, как и синтез ДНК, происходит в направлении РНК-полимераза отличается от ДНК-полимеразы тем, что не нуждается в затравке и не обладает нуклеазными активностями. Еще одно отличие состоит в том, что ДНК-матрица при синтезе РНК полностью сохраняется, тогда как при синтезе ДНК она сохраняется наполовину. РНК-полимераза Е. coli имеет субъединичную структуру и массу, достигающую Корфермент имеет состав Сигма-субъединица увеличивает скорость и специфичность транскрипции, так как она обеспечивает узнавание РНК-полимеразой сигналов начала транскрипции в матричной ДНК. Связывание РНК-полимеразы с такими промоторными участками вызывает локальное расплетание матрицы, что создает условия для образования первой фосфодиэфирной связи. Цепи РНК начинаются с или После инициации синтеза новой цепи сигма-субъединица отделяется от голофермента. Терминация транскрипции так же тонко регулируется, как и инициация. Матричная ДНК содержит стоп-сигналы транскрипции. Некоторые из этих сигналов узнает белок Некоторые специфические ингибиторы могут блокировать транскрипцию. Например, антибиотик рифампицин ингибирует инициацию синтеза РНК, а актиномицин D блокирует элонгацию РНК. Многие молекулы РНК подвергаются после транскрипции расщеплению и химической модификации (например, метилируются). У прокариот молекулы тРНК и рРНК подвергаются интенсивному процессингу, а молекулы мРНК почти не претерпевают модификаций. У эукариот все транскрипты сильно модифицируются.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

(см. скан)

Вопросы и задачи

(см. скан)

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление